熒光顯微鏡的基本操作及注意事項

    1．熒光顯微鏡基本操作步驟

    (1)安裝紫外防護罩。

    (2)打開高壓汞燈的電源控制箱開關。

    (3)插入擋光板，中斷光路。

    (4)預熱5―10分鐘。

    (5)將載有樣品的載玻片放到載物臺上。

    (6)選擇接物鏡(按照先低倍，后高倍順序)。

    (7)旋轉分光鏡組件轉盤，選擇所需要的分光鏡組件：“O”為觀察透射光時用；“WU”為觀察藍色熒光時用(如DAPl)；“WB”為觀察綠色熒光時用(如FITC)；“WG"為觀察紅色熒光時用(如TRITC)。

    (8)使用阻斷濾片(目前多數阻斷濾片內置于熒光顯微鏡)。

    (9)通過粗、細螺旋調整焦距。

    (10)打開與顯微鏡連接的計算機，點擊數碼成像系統軟件，采集數碼圖像。

    2．熒光顯微鏡使用注意事項

    (1)因觀察熒光使用的光源為高壓汞燈，其中發出的光含紫外光，對人眼有損害作用，故必須安裝紫外防護罩。為了避免紫外線對眼睛的傷害，調節光源時需要帶上防護眼鏡。

    (2)為延長汞燈壽命，打開汞燈后不可立即關閉，以免水銀蒸發不完全而損壞電極，一般需要等15分鐘后才能關閉。

    (3)汞燈熄滅后待完全冷卻才能重新啟動，否則燈內汞蒸氣尚未恢復到液態，內阻極小，再次施加電壓，會引起短路，導致汞燈爆炸。這樣不僅損壞電器，更重要的是汞蒸氣溢出，將導致工作室污染。故關閉汞燈之后，不能馬上再次打開，必須等待至少30分鐘。

    (4)高壓汞燈工作時會散發大量的熱量，因此，工作環境溫度不宜太高，必須有良好的散熱條件。

    (5)汞燈的使用壽命約200―300小時，在電源控制箱上有時間累計計數器，使用者要記錄累計小時數，達到300小時，需更換新燈泡，否則亮度不夠，影響觀察。由于光源是有一定使用壽命的，所以一切步驟都需要節約時間，從而保護光源，讓它的使用壽命最長化。

    3．熒光顯微鏡標本制作特點和觀察要求

    (1)載玻片：載玻片厚度應在0．8―1．2mm之間，玻片太厚吸收光多，激發光難以在標本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發熒光。有時需用石英玻璃載玻片。

    (2)蓋玻片：蓋玻片厚度應約0．17mm，光潔。為加強激發光，也可用干涉蓋玻片，這種特制蓋玻片的表面鍍有若干層對不同波長的光起不同干涉作用的物質(如氟化鎂)，它可以使熒光順利通過而反射激發光，這種反射的激發光可激發標本中的熒光。

    (3)標本：組織切片或其他標本不能太厚，一般以5～20pm為宜，切片太厚可使激發光大部分消耗在標本下部，而物鏡直接觀察的標本上部不能被激發。切片折疊或雜質過多均可影響熒光的觀察。

    (4)封片劑：封片劑必須無自發熒光、五色透明。加上抗淬滅劑后再用指甲油(實際操作中體會指甲油封片效果很好，可做到薄而均勻)將蓋玻片四周封固，既保持蓋玻片不滑動，又能防止抗淬滅劑蒸發。在沒有抗淬滅劑的情況下，也可使用含30％甘油的PBS，還可用甘油與0．5mol／L碳酸鹽緩沖液(pH9．0～9．5)等量混合液作封片劑。

    (5)鏡頭的清潔：在油鏡使用完畢后，需用擦鏡紙沾上無水乙醇或3：7的醇醚混合液輕輕擦拭。

    (6)及時觀察：標本染色后應及時觀察，因時間過長熒光會逐漸減弱。若標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間。

    作為光學顯微鏡的其中一個分支，熒光顯微鏡被廣泛應用在免疫熒光細胞化學研究中。它的光源比較特殊，是紫外線，被紫外線照射過的被檢物體會呈現出熒光，從而被研究者進行觀察分析。

    一、熒光顯微鏡與普通顯微鏡區別

    1、光源：普通顯微鏡采用的是普通的自然光，而它采用的是波長短，分辨率高的紫外線。

    2、照明方式：熒光顯微鏡采用的是較為特殊的落射式，將光源直接投射在樣品上。

    3、濾光片：為了保護觀察者的眼睛，熒光顯微鏡在目鏡和物鏡之間安裝了可以過濾掉傷眼的紫外線的濾光片。

    二、使用方法：

    1、第一步首先要將燈源打開，然后預熱十五分鐘使之達到最亮。

    2、先用低倍鏡進行觀察，調整裝置，使光源的中心處于照明光斑的正中央，便于觀察。

    3、放置被觀察的而物質。切忌，要在安裝濾光片之后再行觀察。因為紫外線會大大損害人的眼睛。

    體視熒光顯微鏡的應用與注意

    一、將材料片放在顯微鏡的載物臺上。

    二、打開熒光顯微鏡穩壓器，然后啟動紫外燈，紫外燈15min內不得關閉，關閉后3min內不得再啟動。

    三、將激發濾光片轉至v，分色片調到v，選用495或475nm阻擋濾光片。

    四、選用uvFL40、uvFL100熒光接物鏡鏡檢。

    五、在玻片上加無熒光油，先用40x，再用100x調焦鏡檢．呈現熒光。

    六、因熒光物質受紫外光照射時隨時間的增長熒光逐漸變弱，因此鏡檢時應經常變換視野。

    七、亦可用uvFL10或uvFL20低倍鏡鏡檢材料(用低倍鏡時不加無熒光油)。

    熒光圖像的記錄方法：

    熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態學特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結果時，必須將二者結合起來綜合判斷。結果記錄根據主觀指標，即憑工作者目力觀察。作為一般定性觀察，基本上可靠的。隨著技術科學的發展，在不同程度上采用客觀指標記錄判斷結果，如用細胞分光光度計，圖像分析儀等儀器。但這些儀器記錄的結果，也必須結合主觀的判斷。

    熒光顯微鏡攝影技術對于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易褪色減弱，要即時攝影記錄結果。方法與普通顯微攝影技術基本相同。只是需要采用高速感光膠片如ASA200以上或24。以上。因紫外光對熒光猝滅作用大，如FITC的標記物，在紫外光下照射30s，熒光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能將熒光圖像拍攝下來。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動或全自動顯微攝影系統裝置。

    熒光顯微光學系統需要優先考慮的是:

    (1)光學系統組成的材料應選用在激發光波內無熒光材料,不但指光學系統玻璃也包括膠合制造中的膠合劑、切片、蓋玻片和浸液以及密封劑。若有自發熒光,不但會增加背景光,有時還會混淆觀察熒光圖像。

    (2)光學系統的參數選擇中,應將獲得最大光能作為第一考慮因素。

    照明系統中集光鏡應選用最大的包容角;采用柯勒照明并使燈絲或弧光像充滿入瞳,以期望獲得高效率的均勻照明。

    收集熒光成像的物鏡,因為像面照度與數值孔徑NA2成正式,為此作為熒光用物鏡應有較大的NA值。目前10×已達015;20×達0175;40×達019;油鏡40×達113。

    雙目鏡筒作為熒光用時應在可見光譜段有較高的透過率,采用鍍膜技術可大大地減少光能的損失,它可比一般雙目鏡筒透射率提高一倍,這對弱熒光物質觀察是必須的。

    目鏡放大率不宜選大,因為象面照度與目鏡放大率平方成反比。若其它條件相同,當用613×目鏡時,照度定為100%,換上1215×時,照度約為25%,因此常在4×～613×之間選用。

    由此表明,用不同物鏡和目鏡組合成同一倍率的顯微鏡時,象面照度和曝光系數可相差數倍,對于熒光觀察最佳組合是選用低倍率目鏡和NA大的物鏡最為合適。

    (3)作為熒光光學系統各組成部件的光譜特性也是至關重要的,特別是紫外光要通過的部件,如照明系統,聚光鏡以及物鏡,要關注紫光區的透射系數。聚光鏡要選用透紫外線的材料。照明系統中反光鏡表面鍍鋁比鍍銀好,因為鋁在UV和V區反射率在90%以上,而銀僅達70%。加拿大膠吸收紫外線,在紫外區通過處不宜用作膠合劑。