自然界中有許多發光過程。發光是發光不是高溫導致的那些事件的總稱。本文描述了不同形式的發光，并詳細介紹了熒光的情況。在文章的第二部分中解釋了描述熒光染料的相關技術術語，例如淬滅，漂白或量子產率，以深入了解熒光分子的基本特征。

    徠卡熒光顯微鏡-發光過程

    一些非常常見的生物學或生化實驗室方法是基于幾種“發光”的存在，例如磷光，化學發光，生物發光以及最終的熒光。作為熒光蛋白主題的介紹，可能需要更多地了解“熒光”。這些現象的起源是拉丁語see-escentia，它已經暗示了與我們視覺系統的聯系。所有“…發光”都描述了我們可以用眼睛感知到的物理，化學或生物過程。我們在表示變化，動作或過程的詞上添加后綴“…escent”，如恢復期。

    因此很明顯，熒光是我們可以看到的，并且與變化或過程有關。稍后我們將學習熒光如何滿足這些條件。首先，我們將簡要介紹一下其他本身都是發光的“…發光”。發光是發光的通稱，不是高溫的影響。因此，可以將發光確定為冷體輻射的外觀。這種輻射可能是化學反應的一部分，也可能是亞原子運動或晶體應力的原因。產生輻射的另一種方法是白熾燈，其中物質由于熱（例如，鐵水）而發光。

    化學發光是基于化學反應的發光過程，其中產物具有受激的中間體。當進入基態時，該中間體發光。與熒光不同，化學發光材料中的電子是通過化學反應而不是通過吸收光子來激發的?；瘜W發光例如在熒光棒中找到了技術應用。眾所周知的化學發光物質是魯米諾，它在犯罪學領域用于發現血液痕跡。在此，存在于血紅蛋白中的Fe2+離子起將Luminol變為其發光構型的催化劑的作用。

    如果生物體發光，那么無論這種光如何產生，我們都說生物發光。有許多生物發光，例如螢火蟲或螢火蟲。杰克·奧蘭登蘑菇（羊形眼線蟲）是排在其他幾種真菌中的非常特殊的生物，它在黑暗中發光。許多海洋生物，例如一些珊瑚，藻類，十字花科植物甚至魷魚，都發出光，大部分是藍色或綠色的。另一個海洋居民是發光生物的水母維多利亞水母，綠色熒光蛋白（GFP）的來源。例如，螢火蟲僅使用化學發光過程產生光，而維多利亞州使用化學發光和熒光過程。作為科學家發現，水母通過與蛋白質的幫助下發生化學反應生成藍色光的水母發光蛋白。然后，該藍光用于在熒光反應中激發已經提到的GFP，從而發出綠色光。

    這就引出了一個問題：“什么是熒光？”熒光是一種物質吸收較短波長的光而發光的過程。波長的差異稱為斯托克頻移。詳細地，如果物質吸收光子形式的光，則發生熒光。這導致電子轉移到更高的能級。但是這種高能態非常不穩定，這就是為什么電子傾向于返回其基態的原因。在此過程中，能量再次以光子的形式釋放，可以看作是輝光。與磷光相反，電子的能量遷移非?？?，實際上在納秒范圍內（圖1）。在用另一種不同的波長激發后能夠發出不同波長的光的任何物質稱為熒光染料。這些將在下一節中討論。自然界中出現的大多數熒光物質都具有較寬的激發和發射光譜，但是具有明確定義的激發和發射最大值的物質對于熒光顯微鏡更為有用。

    類似于熒光，磷光是一種發光現象，其中磷光材料被光激發。即使它與熒光密切相關，但速度要慢得多。與熒光相反，光子的重新發射通過激發電子能量與“禁止”狀態的結合而減速。由于能量被“捕獲”，它們返回基態的速度不像熒光燈那樣快。磷光材料的典型示例是“黑暗中發光”玩具，可以用普通的燈泡或日光“充電”，然后發光幾分鐘甚至幾小時。

    徠卡熒光顯微鏡-熒光色素

    如上所述，熒光染料是任何能夠發出熒光的物質。在我們的情況下，熒光蛋白是熒光染料。在詳細介紹之前，我們將介紹一些描述熒光蛋白的術語和表達。與熒光相關的非常常用的詞是熒光團：熒光團是分子（例如蛋白質）中負責其熒光能力的部分。因此，GFP或其衍生物是與GFP或其衍生物相連的任何雜合蛋白（例如α-Tubulin-GFP）的熒光團。但是熒光團不必一定是蛋白質。FITC等小分子，TRITC（20個原子）或量子點（100–100,000個原子）等也是熒光團。

    熒光蛋白的層次結構

    深入觀察熒光團，我們到達發色團，該發色團是定義其顏色的分子的一部分（圖2）。在發色團內部，發生了電子的能級轉換和相互關聯的光發射（參見上文）。生色團至少有兩種形式。它們是由共軛π電子共振系統（GFP）或金屬絡合物（葉綠素，血紅素）構建的。

    由于其與顯微鏡的相關性，我們將仔細研究GFP的發色團。事實證明，對于GFP生色團的形成，除了分子氧以外，不需要其他輔助因子或酶成分。由GFP氨基酸主鏈的一級結構定義，它以自催化折疊機制自發形成，并通過分子內重排完成。詳細地說，發色團是由三種相關的氨基酸組成的。Ser65，Tyr66和Gly67經過環化，脫水和氧化先后。這些反應的結果是共軛π電子共振系統，GFP發色團。

    從整個GFP結構來看，環狀三肽位于圓柱體的中間。該圓柱體由11條鏈組成，形成β桶狀結構，從而使蛋白質具有很高的穩定性。β桶結構的直徑約為3nm，高度約為4nm（見圖3）。迄今為止已知的所有FP均具有該保護筒，該保護筒對其光物理性質有很大的影響。在GFP的情況下，量子產率和光穩定性較高。此外，非常緊湊的蛋白質結構導致很高的抗pH值。帶有GFP標簽的樣品在溫度方面相對穩定，并且對變性物質如多聚甲醛，尿素或鹽酸胍具有很高的耐受性。

    綠色熒光蛋白（GFP）的分子結構

    徠卡熒光顯微鏡-淬滅和漂白

    但是，對于FP仍存在某些限制和限制，這將在下一節中提到。例如，淬滅過程以可逆的方式降低了熒光團的強度。這種衰減有多種原因。一方面，可能存在復雜的結構或內部轉換。另一方面，淬滅可能是能量轉移過程的結果。稱為FRET的微觀應用程序利用了此過程。在福斯特共振能量轉移或熒光共振能量轉移期間，供體熒光團D的能量轉移至受體熒光團A。D的熒光減少，而A的熒光增加。

    與淬滅是可逆的過程相反，存在不可逆的熒光減少過程，稱為漂白。永久性熒光損失是基于長時間暴露于激發光會破壞熒光團。漂白量取決于強度，曝光時間和光源的能量。每個熒光團在漂白之前都有一定數量的激發和發射循環。對于GFP，每個分子可以被激發約104–105。這符合0.1–1s。

    使用共聚焦激光掃描顯微鏡，光強度通常約為106W/m2。這種高能量劑量會產生過量的光子，從而導致許多熒光分子處于激發態的現象。在這種情況下，它們不再吸收正常波長的光。有了它，有效的染料濃度就降低了，換句話說，監視器上顯示的像素不再是染料濃度的直接函數。與使用簡單的弧光燈進行照明相反，使用高能激光會導致發射和激發之間存在非線性關系。

    徠卡熒光顯微鏡-量子產率

    談到熒光蛋白的效率，我們應該提到量子產率。這是熒光團的另一個特征，比較光子的輸入和輸出。為了計算某種熒光團的量子產率，將發射的光子除以吸收的光子：

    因此，對于100％的產率，量子產率將為1。用于激發的每個光子將在發射中產生一個光子。但是，這僅是理論值。實際上，激發所花費的光子要比發射光所吸收的光子多。例如，GFP的量子產率為0.6（參見表1）。換句話說，要在發射中獲得6個光子，必須使用10個光子進行激發。

    徠卡熒光顯微鏡-亮度

    熒光蛋白的亮度是應用熒光顯微鏡檢查時要考慮的另一個重要特征。根據顯微鏡的質量，此參數是實驗成功的關鍵點。確定熒光蛋白亮度的一種客觀方法是將其摩爾消光系數乘以其量子產率除以1,000。物質的摩爾消光系數告訴我們有關其在不同波長處的光吸收的信息。詳細地，摩爾消光系數是在不同波長下，在1cm距離上具有摩爾濃度的物質吸收電磁輻射的尺寸。因此，對應的單位是M–1cm–1。

    借助此計算，可以比較不同熒光蛋白的亮度。如果我們以摩爾消光系數為56,000M–1cm–1且量子產率為0.6的EGFP為例，則得出的值為33.6M–1cm–1。有時人們談論熒光蛋白的相對亮度。在這種情況下，可通過將摩爾消光系數乘以量子產率，再除以EGFP的亮度值（33.6M–1cm–1）來計算亮度。通過這樣做，可以將相對亮度轉換為眾所周知的EGFP，從而可以更快地比較不同的熒光蛋白。

    徠卡熒光顯微鏡-光穩定性

    許多熒光顯微鏡實驗涉及活細胞的觀察?？紤]到淬滅和漂白等特性，很明顯，生命細胞成像高度依賴于時間。即使在組織學或固定細胞樣品的情況下，重要的是不要長時間照射樣品和太強的光強度。描述感興趣的熒光蛋白抵抗降解其熒光行為的機制的能力的參數是光穩定性。光穩定性表示為直到50％的初始亮度消失之前經過的秒數。為了進行比較，弧光燈提供的照明最大為10W/cm2，而激光等高強度光源（高達100W/cm2）可能會產生非線性影響。此外，為了測量和比較光穩定性，將熒光蛋白樣品的pH值標準化為7.0，并使蛋白溶液的液滴適應典型哺乳動物細胞的大小。上述光源連續照明。并行地計算光子的發射。對于EGFP，它需要174秒的時間才能恢復到原來亮度的一半（Shaner等人，2005年）。換句話說，發射從1,000光子/秒減少到500光子/秒需要174秒。

    知道某種熒光染料或蛋白質的不同特征（例如激發和發射最大值，亮度，量子產率等）后，實驗人員便能夠選擇不同的候選物或觀察條件，以滿足其對特定實驗設置的要求。此外，如果他知道不同熒光染料或蛋白質的光物理特征，則能夠以詳細的方式解釋結果。