一、熒光
普通光是由發光體質點的熱運動所引起的輻射；而熒光是非溫度輻射，是一種冷光。熒光有多種，如光化熒光（由光源激發而產生的熒光），放射出熒光（由放射性物質激發而產生的熒光）。生物熒光（如磷的氧化時發出的熒光），等等。而熒光顯微鏡則是利用光化熒光這原理設計制造，達到熒光顯微術鏡檢的目的，這個也是其工作原理。
由于熒光顯微鏡的光源是利用人眼不可見的短波光，因而就大大提高了物鏡的分辨率，圖像與背景的反差亦甚為明顯。
二、熒光現象的原理
將熒光物體放到光譜中的各色區域，就可發現引起熒光最有效的光線是光譜上波長較短的區域，即近紫外線區域，波長約為320-400nm。這種現象的實質是分子吸收了短光的能量（波長越短，光能越強），又以發光的形式以波長較長和熒光射出，而為人眼可見，這就是熒光現象。熒光接近可見光的紅光端，大部分的熒光現象是符合這一規律的。
熒光現象可分為兩種：
1.第一次熒光現象；又稱固有熒光或自發熒光，當經紫外線的照射后，就能發出熒光的物質；
2.第二次熒光現象：又稱激發熒光，當經紫外線照射后不能或只部分發生微弱的熒光，這樣就需先用熒光素處理，再經紫外線照射才能發生熒光，這是因組織內吸附或溶解有熒光素的緣故。
三、熒光顯微鏡的原理
濾色塊是熒光顯微鏡的重要部位，其核心部件由激發光濾色片（firstbarrierfilter）、發射光濾色片（secondbarrierfilter）和半透半反濾色片(beam-splittingmirror)組成。
1．激發光濾色片及發射光濾色片：根據光源和熒光色素的特點，通常選用以下三類配套，提供一定波長范圍的激發光，并使樣品激發出的熒光透過，到達目鏡成像，此為其成像的原理。
紫外光激發：激發光濾色片可使紫外光透過，阻擋400nm以上的可見光通過。與之相應的發射光濾色片可允許藍光通過，視野內的光呈藍色，如應用于DAPI染色。
藍光激發：激發光濾色片可使藍光通過，阻擋其他波段的光。與之相應的發射光濾色片可允許綠光通過，如GFP染色標記。
綠光激發：激發光濾色片使綠光通過，阻擋其他波段的光。與之相應的發射光濾色片通?？稍试S紅光通過，如Rhodamine染色。
2．半透半反濾色片：它的作用是完全阻擋激發光通過，而將其反射；并透過相應波長范圍的發射光。其型號與激發光濾色片和發射光濾色片相對應。
3.光路：光線在熒光濾色塊中的傳播光路為：反射光濾光片只允許光源中特定波長的光線透過，這部分激發光到達半透半返濾色片時被反射后通過物鏡照射到樣品上，樣品中的熒光基團被激發光激發，發射出長波長的熒光；發射光通過物鏡，透過半透半反濾色片，到達發射光濾色片，此時又只有特定波長的光線透過，通過目鏡被我們肉眼看到的就是樣品中的熒光了。
熒光顯微鏡是利用一個高發光效率的點光源，經過濾色系統發出一定波長的光(如紫外光3650入或紫藍光4200入)作為激發光、激發標本內的熒光物質發射出各種不同顏色的熒光后，再通過物鏡和目鏡的放大進行觀察。這樣在強烈的對襯背景下，即使熒光很微弱也易辨認，敏感性高，主要用于細胞結構和功能以及化學成分等的研究，這個是其工作原理。
下圖是熒光顯微鏡的光學系統原理圖。由汞燈發出的各種譜線的光線，經激發濾光片后只讓某一種波長的紫外光線通過，如波長為404.7nm藍紫光，經反光鏡后，激發樣品產生熒光。激發濾光片將其他波長的光線濾掉，并使樣品激發熒光，所以稱其為激發濾光片。通常，激發產生的熒光波長比激發樣品的光的波長大得多，是可見光。這樣產生的熒光和透過樣品的一部分激發光(紫外光)，經物鏡成像后，人眼即可用目鏡觀察熒光圖像。為了防止紫外光進入目鏡視場，降低圖像襯度和損傷人眼，放置了一塊截止濾光片，它只讓某一部分波長的譜線通過，如只讓500～750nm的可見光通過，而不讓500nm以下的光通過。
從圖中可以看出，光源是熒光顯微鏡主要組成部分，熒光顯微鏡都采用200W的超高壓汞燈作光源。它是由石英玻璃制作，中間呈球形，內充有一定量的汞，工作時在兩極間放電，引起水銀蒸發，球內氣壓迅速升高，當水銀完全蒸發時，可達50～70個標準大氣壓力，這一過程一般約5～15min。超高壓汞燈的發光是電極間放電使水銀分子在不斷解離和還原過程中發射光量子的結果。它發射很強的紫光，足以激發各類熒光物質，因此被熒光顯微鏡普遍采用。
四、熒光顯微鏡的結構特點：
熒光顯微鏡的基本構造是由普通光學顯微鏡加上一些附件(如熒光光源、激發濾片、雙色束分離器和阻斷濾片等)的基礎上組成的。
熒光光源——般采用超高壓汞燈(50一200W)，它可發出各種波長的光，但每種熒光物質都有一個產生最強熒光的激發光波長，所以需加用激發濾片(一般有紫外、紫色、藍色和綠色激發濾片)，僅使一定波長的激發光透過照射到標本上，而將其他光都吸收掉。每種物質被激發光照射后，在極短時間內發射出較照射波長更長的可見熒光。熒光具有專一性，一般都比激發光弱，為能觀察到專一的熒光，在物鏡后面需加阻斷(或壓制)濾光片。它的作用有二：一是吸收和阻擋激發光進入目鏡、以免于擾熒光和損傷眼睛，二是選擇并讓特異的熒光透過，表現出專一的熒光色彩。兩種濾光片必須選擇配合使用。
熒光顯微鏡就其光路來分有兩種：
1.透射式熒光顯微鏡:激發光源是通過聚光鏡穿過標本材料來激發熒光的。常用暗視野集光器，也可用普通集光器，調節反光鏡使激發光轉射和旁射到標本上.這是比較舊式的熒光顯微鏡。其優點是低倍鏡時熒光強，而缺點是隨放大倍數增加其熒光減弱.所以對觀察較大的標本材料較好。
2.落射式熒光顯微鏡這是近代發展起來的新式熒光顯微鏡，與上不同處是激發光從物鏡向下落射到標本表面，即用同一物鏡作為照明聚光器和收集熒光的物鏡。光路中需加上一個雙色束分離器，它與光鈾呈45。角，激發光被反射到物鏡中，并聚集在樣品上，樣品所產生的熒光以及由物鏡透鏡表面、蓋玻片表面反射的激發光同時進入物鏡，反回到雙色束分離器，使激發光和熒光分開，殘余激發光再被阻斷濾片吸收。如換用不同的激發濾片/雙色束分離器/阻斷濾片的組合插塊，可滿足不同熒光反應產物的需要。此種熒光顯微鏡的優點是視野照明均勻，成像清晰，放大倍數愈大熒光愈強。
五、熒光顯微鏡使用方法.
1.打開燈源，超高壓汞燈要預熱幾分鐘才能達到更亮點。
2.透射式熒光顯微鏡需在燈源與聚光器之間裝上所要求的激發濾片，在物鏡的后面裝上相應的阻斷濾片。落射式熒光顯微鏡需在光路的插槽中插入所要求的激發濾片/雙色束分離器/阻斷濾片的插塊。
3.用低倍鏡觀察，根據不同型號熒光顯微鏡的調節裝置，調整光源中心，使其位于整個照明光斑的中央。
4.放置標本片，調焦后即可觀察。使用中應注意：末裝濾光片不要用眼直接觀察，以免引起眼的損傷;用油鏡觀察標本時，必須用無熒光的特殊油鏡;高壓汞燈關閉后不能立即重新打開，需經5分鐘后才能再啟動，否則會不穩定，影響汞燈壽命。
六、觀察在示教臺上的熒光顯微鏡下用藍紫光濾光片，可見經o.01%的丫啶橙熒光染料染色的細胞，細胞核和細胞質被激發產生兩種不同顏色的熒光(暗綠色和橙紅色)。
