熒光顯微鏡的用途
熒光顯微鏡是以紫外線為光源，用以照射被檢物體，使之發出熒光，然后在顯微鏡下觀察物體的形狀及其所在位置。熒光顯微鏡用于研究細胞內物質的吸收、運輸、化學物質的分布及定位等。
熒光顯微鏡的使用步驟及使用方法
1、用窗簾遮蔽光線，關閉房間內的電燈，除去熒光顯微鏡的防塵罩，確保熒光顯微鏡燈室通風良好、無遮蓋。裝上汞燈燈箱，并轉動燈箱卡圈上的撥桿，將燈箱與鏡臂連接。
2、將汞燈燈箱的電源插頭插入熒光電源箱后的插座，再將熒光電源箱的插頭插入220V外接電源。
3、打開熒光顯微鏡電源開關，電壓表顯示出電源電壓，如電源電壓波動不大于額定電壓值的5%，即可按下啟動開關點燃汞燈，如因天氣太冷或電壓不穩定等原因，一次啟動未點燃汞燈，可以多按幾次。待超高壓汞燈弧光達到穩定狀態并達到Zda發光效率，即可開始工作。
4、燈泡的調中：
①任選一塊標本放在熒光顯微鏡載物臺上。
②轉動鏡臂上的聚光鏡旋鈕使聚光鏡移出光路，轉動濾色片組轉換手輪，將紫光(V)或藍光(B)或綠光(G)激發濾色片組轉入光路，并將25熒光物鏡轉入光路。
③調節粗微調手輪，將標本像調焦清晰。
④前后推動垂直照明器右邊的聚光鏡調焦推桿，使視場光欄成像清晰，轉動視場光欄撥桿將視場光欄收小，調節視場光欄調中螺釘使視場光欄居中，然后再將視場光欄開至Zda。
⑤轉動鏡臂上的聚光鏡旋鈕使聚光鏡移入光路，前后調節燈箱上的聚光鏡撥桿，使汞燈的弧光在視場內成像清晰。
⑥調整燈箱上的燈泡水平調節螺釘和垂直調節螺釘，使汞燈的弧光居中。
⑦調整反光鏡水平調節螺釘和垂直調節螺釘，使光源的反射像與汞燈的弧光分開。
⑧轉動聚光鏡旋鈕把聚光鏡移出光路，此時視場照明均勻。
5、熒光觀察：
①將熒光染色標本放到熒光顯微鏡載物臺上。
②將10x平場物鏡或25x熒光物鏡轉入光路，調節載物臺縱橫移動手輪，將標本移入光路。
③轉動濾光片轉換撥輪，將熒光染色標本所需要的激發濾光片組轉入光路。激發濾光片組編號刻在濾片組轉換撥輪上。濾光片選擇正確與否，是熒光顯微鏡能否得到正確應用的關鍵。選用濾光片時，必須遵守斯托克斯定律：激發濾光片的透射波長<雙色束分離器的透射波長<阻斷濾光片的透射波長。
④調節粗調手輪，當看清熒光圖像輪廓后，再用微調手輪調焦，直至看到清晰的熒光圖像。
⑤當需要得到較強的熒光圖像時，可轉動聚光鏡旋鈕把聚光鏡移入光路，可獲得較明亮的熒光圖像。
⑥當需要使用40x或100x熒光物鏡觀察時，應在標本和物鏡間加上甘油，油中不能有影響觀察的小泡或雜質。使用時可使甘油慢慢浸潤一會兒，然后輕輕左右來回轉動物鏡轉換器以排除氣泡。
6、熒光顯微攝影
由于熒光圖像一般均較明場觀察暗得多，所以進行熒光顯微攝影需要較長的曝光時間，在曝光時應注意避免熒光顯微鏡震動。為了縮短曝光時間，可選擇倍率較低的攝影目鏡或感光度較高的攝影膠片如ASA200以上或DIN24以上。
熒光顯微鏡攝影技術對于記錄熒光圖像十分必要，由于熒光很易褪色減弱，要即時攝影記錄結果。方法與普通顯微攝影技術基本相同。因紫外光對熒光猝滅作用大，如FITC的標記物，在紫外光下照射30s，熒光亮度降低50%。所以，曝光速度太慢，就不能將熒光圖像拍攝下來。一般研究型熒光顯微鏡都有半自動或全自動顯微攝影系統裝置。
7、熒光圖像的記錄方法
熒光顯微鏡所看到的熒光圖像，一是具有形態學特征，二是具有熒光的顏色和亮度，在判斷結果時，必須將二者結合起來綜合判斷。結果記錄根據主觀指標，即憑工作者目力觀察。作為一般定性觀察，基本上是可靠的。
8、熒光顯微鏡使用結束，關閉所有電源，做好鏡頭和載物臺的清潔工作，待燈室冷卻至室溫后，用防塵罩蓋好顯微鏡，并做好使用記錄。
奧林巴斯熒光顯微鏡操作使用步驟
1、使用前確保你已經熟悉顯微鏡的基本操作，否則不允許操作。
2、先開電源（ON），啟動發光器，再開照相機電源。以免先照相機再開熒光顯微鏡電源時，強大電源將照相機電子零件燒損。
3、在顯微鏡下找到需要的物象后，打開電腦的成像系統。需要使用熒光時，請務必預熱熒光燈電源15分鐘。
4、選擇濾鏡，將濾鏡推入（以免光線向外散失）后，于暗室下開始觀察。應一次把全部玻片觀察完畢，勿中途切斷電源，否則須待冷卻后（約30分鐘）才能再開電源。最少開機30分鐘才可關機，以免縮短燈泡壽命。
5、熒光色素于普通光線照射下易消失，故未觀察之標本宜置不透光盒內儲存于冰箱（4～5℃）。而在熒光顯微鏡之紫外線照射下亦易使熒光消失，故照像宜速。
6、等冷卻后，再將防塵罩罩上。
7、測試完畢后，請認真填寫登記表格。
8、本區春夏氣候潮濕，存放熒光顯微鏡暗室應有除濕設備，并每星期將熒光顯微鏡至少開機一次，以免顯微鏡發霉損及鏡頭與濾光鏡。
倒置熒光顯微鏡操作使用步驟：
a、相差觀察：
打開明場電源開關（“︱”為開，“○”為關）
將樣品置于載物臺上
將光路選擇旋鈕調至觀察位置
從低倍鏡開始觀察，調節到與鏡頭相匹配的相差環，熒光濾塊轉盤撥到“1”的位置
調節透射光光強，調節焦距，找到預觀察視野
依次換到高倍鏡，（注意調節相差環）觀察樣品
拍照時將光路選擇旋鈕調至相機位置
b、熒光觀察：
打開明場電源開關
打開汞燈開關
將樣品置于載物臺上
將熒光光路shutter打開（“○”為開，“●”為關），需保護樣品時關閉shutter
將光路選擇旋鈕調至觀察位置
根據樣品的標記情況將熒光濾塊轉盤轉到相應的位置
通過兩組減光濾片調節激發光強度
從低倍鏡開始觀察，調焦，找到預觀察視野，
依次換到高倍鏡頭，觀察樣品
拍照時將光路選擇旋鈕調至相機位置
c、普通明場觀察：
打開明場電源開關（“︱”為開，“○”為關）
將樣品置于載物臺上
將光路選擇旋鈕調至觀察位置
從低倍鏡開始觀察，相差環撥到明場（BF）位置，熒光濾色塊轉盤撥到“1”的位置
調節透射光光強，調焦，找到預觀察視野
依次換到高倍鏡，觀察樣品
拍照時將光路選擇旋鈕調至相機位置
d、關機：
關閉汞燈電源（注意：汞燈需使用半小時以上方可關閉，關閉半小時以后方可再次開啟）
將透射光強調到最小，透射光選擇按鈕按出
關閉明場電源開關
將鏡頭轉到低倍鏡，取出樣品，若使用過油鏡用干凈的擦鏡紙擦拭鏡頭
確認數據已經保存，關閉軟件
使用光盤拷貝數據（禁止使用移動儲存設備拷貝數據）
關閉電腦，登記使用時間、熒光數字等使用情況
熒光顯微鏡使用方法：
(1)將物料板放在舞臺上。
（2）打開調節器熒光顯微鏡。然后按下啟動一套UV燈不能接近15分鐘內點燃，后收盤不能重新啟動3分鐘。
（3）將激勵濾波器轉換為V，將分色器調整為V，選擇495或475nm阻塞濾波器。
(4)使用uvfl40、uvfl100螢光鏡檢查。
(5)將非熒光油加入到載玻片上，首先使用40X，然后用100X聚焦顯微鏡檢測熒光。
（7）由于在由隨時間推移的UV熒光增加照射熒光物質逐漸減弱，因此應不斷變化的視野檢查。
（8）紫外FL10或紫外FL20也可用作低倍顯微鏡材料（使用低倍顯微鏡時不加熒光油）。
熒光顯微鏡使用注意事項
1、嚴格按照熒光顯微鏡說明書要求進行操作，不要隨意改變程序。
2、熒光顯微鏡應在暗室中進行檢查。進入暗室后，接上電源，點燃超高壓汞燈5～15min，待光源發出強光穩定后，眼睛完全適應暗室，再開始觀察標本。
3、防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡。
4、檢查時間每次以1～2h為宜，超過90min，超高壓汞燈發光強度逐漸下降，熒光減弱;標本受紫外線照射3～5min后，熒光也明顯減弱;所以，Z多不得超過2～3h。
5、熒光顯微鏡光源壽命有限，標本應集中檢查，以節省時間，保護光源。天熱時，應加電扇散熱降溫，新換燈泡應從開始就記錄使用時間。燈熄滅后欲再用時，須待燈泡充分冷卻后才能點燃。一天中應避免數次點燃光源。
6、標本染色后立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發。
7、熒光亮度的判斷標準：一般分為四級，即“-”表示無或可見微弱熒光?！?”表示僅能見明確可見的熒光?！?+”表示可見有明亮的熒光?！?++”表示可見耀眼的熒光。
熒光顯微鏡標本制作要求
1、載玻片
載玻片厚度應在0.8～1.2mm之間，太厚的坡片，一方面光吸收多，另一方面不能使激發光在標本上聚集。載玻片必須光潔，厚度均勻，無明顯自發熒光。有時需用石英玻璃載玻片。
2、蓋玻片
蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強激發光，也可用干涉蓋玻片，這是一種特制的表面鍍有若干層對不同波長的光起不同干涉作用的物質(如氟化鎂)的蓋玻片，它可以使熒光順利通過，而反射激發光，這種反射的激發光方可激發標本。
3、標本
組織切片或其他標本不能太厚，如太厚激發光大部分消耗在標本下部，而物鏡直接觀察到的上部不充分激發。另外，細胞重迭或雜質掩蓋，影響判斷。
4、封裱劑
封裱劑常用甘油，必須無自發熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.5~9.5時較亮，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/lpH9.0～9.5的碳酸鹽緩沖液的等量混合液作封裱劑。
5、鏡油
一般暗視野熒光顯微鏡和用油鏡觀察標本時，必須使用鏡油，Z好使用特制的無熒光鏡油，也可用甘油代替，液體石蠟也可用，只是折光率較低，對圖像質量略有影響。
熒光顯微光學系統需要優先考慮的是:
(1)光學系統組成的材料應選用在激發光波內無熒光材料,不但指光學系統玻璃也包括膠合制造中的膠合劑、切片、蓋玻片和浸液以及密封劑。若有自發熒光,不但會增加背景光,有時還會混淆觀察熒光圖像。
(2)光學系統的參數選擇中,應將獲得更大光能作為首考慮因素。
照明系統中集光鏡應選用更大的包容角;采用柯勒照明并使燈絲或弧光像充滿入瞳,以期望獲得高效率的均勻照明。
收集熒光成像的物鏡,因為像面照度與數值孔徑NA2成正式,為此作為熒光用物鏡應有較大的NA值。目前10×已達015;20×達0175;40×達019;油鏡40×達113。
雙目鏡筒作為熒光用時應在可見光譜段有較高的透過率,采用鍍膜技術可大大地減少光能的損失,它可比一般雙目鏡筒透射率提高一倍,這對弱熒光物質觀察是必須的。
目鏡放大率不宜選大,因為象面照度與目鏡放大率平方成反比。若其它條件相同,當用613×目鏡時,照度定為100,換上1215×時,照度約為25%,因此常在4×～613×之間選用。
由此表明,用不同物鏡和目鏡組合成同一倍率的顯微鏡時,象面照度和曝光系數可相差數倍,對于熒光觀察更佳組合是選用低倍率目鏡和NA大的物鏡更為合適。
(3)作為熒光光學系統各組成部件的光譜特性也是至關重要的,特別是紫外光要通過的部件,如照明系統,聚光鏡以及物鏡,要關注紫光區的透射系數。聚光鏡要選用透紫外線的材料。照明系統中反光鏡表面鍍鋁比鍍銀好,因為鋁在UV和V區反射率在90%以上,而銀僅達70%。加拿大膠吸收紫外線,在紫外區通過處不宜用作膠合劑。
