奧林巴斯CKX53倒置熒光顯微鏡觀察干細胞貼壁情況的應用解析

一、CKX53顯微鏡在干細胞貼壁觀察中的核心優勢

1. 倒置設計適配培養容器
   CKX53的倒置光路允許直接觀察培養皿、多孔板或培養瓶中的干細胞，無需轉移樣本，避免污染風險。其長工作距離物鏡（如UPLSAPO 10×/0.40）可覆蓋培養容器底部，確保貼壁細胞全視野成像。

2. 明場與相差觀察的互補性

• 明場模式：快速定位培養區域，觀察細胞密度、形態輪廓及培養基狀態（如氣泡、污染）。

• 相差模式（PH系列物鏡）：增強細胞與背景對比度，清晰顯示干細胞貼壁后的偽足延伸、細胞間連接等微結構，適合觀察未染色的活細胞。

3. 熒光觀察能力
   通過外接熒光模塊（如U-FGFP/U-FRFP等濾光片組），可標記干細胞特異性蛋白（如Oct4-GFP）或細胞骨架（如F-actin-RFP），實現貼壁細胞的分子水平成像。

二、干細胞貼壁觀察的關鍵參數與優化方法

1. 物鏡選擇與分辨率

   
   

   物鏡型號	數值孔徑（NA）	分辨率（μm）	適用場景
   UPLSAPO 10×	0.40	~0.8	全視野掃描、細胞密度評估
   UPLSAPO 20×	0.75	~0.4	偽足動態、細胞間相互作用觀察
   UPLSAPO 40×	0.95	~0.2	亞細胞結構（如核形態）分析

   
   

   建議：初始觀察使用10×物鏡快速定位，細節分析切換至20×或40×物鏡。

2. 光源與照明優化

• 明場/相差：使用內置鹵素燈或LED光源，調節光強至細胞輪廓清晰且無光暈。

• 熒光：選擇高靈敏度LED光源（如U-HGLGPS），避免汞燈的強光毒性對活細胞的影響。

3. 熒光標記策略

• 活細胞標記：使用非侵入性染料（如Calcein-AM標記存活細胞，PI標記死亡細胞）。

• 特異性標記：通過慢病毒轉染表達熒光蛋白（如Oct4-GFP），或免疫熒光染色（如抗SSEA-4抗體+Alexa Fluor 488）。

三、干細胞貼壁觀察的實驗流程與注意事項

1. 樣本制備

• 培養皿預處理：使用多聚賴氨酸或基質膠包被，促進干細胞貼壁。

• 接種密度：建議5×103~1×10? cells/cm2，避免過度擁擠。

• 觀察時間點：接種后24小時（初始貼壁）、48小時（細胞鋪展）、72小時（克隆形成）。

2. 觀察步驟

• 明場定位：10×物鏡快速掃描培養區域，記錄細胞密度與形態。

• 相差成像：切換至20×物鏡，觀察細胞偽足、克隆邊緣形態。

• 熒光檢測：若標記熒光蛋白，使用對應濾光片組（如GFP激發波長470-495 nm，發射波長510-550 nm）。

3. 數據分析

• 貼壁率計算：通過ImageJ等軟件統計貼壁細胞數量與接種總數比值。

• 形態學評分：根據細胞鋪展面積、偽足數量等指標評估貼壁質量。

• 熒光定量：分析熒光強度（如Oct4-GFP表達量）與細胞分化狀態的相關性。

四、常見問題與解決方案

五、CKX53與其他設備的對比與選型建議

1. 與正置顯微鏡對比

• 優勢：倒置設計避免樣本轉移，適合長期活細胞觀察。

• 劣勢：高倍物鏡（如60×/1.40油鏡）需配合特殊培養皿（如玻璃底皿）。

2. 與共聚焦顯微鏡對比

• 優勢：CKX53成本低、操作簡單，適合常規貼壁觀察。

• 劣勢：共聚焦顯微鏡可實現三維成像，但設備昂貴且操作復雜。

3. 選型建議

• 基礎研究：CKX53+相差物鏡+單通道熒光模塊即可滿足需求。

• 高端需求：若需多標記共定位分析，可升級至三通道熒光模塊（如U-FGFP/U-FRFP/U-F594）。

六、總結

奧林巴斯CKX53倒置熒光顯微鏡通過明場、相差與熒光模式的靈活切換，可高效評估干細胞貼壁情況。其長工作距離物鏡與低光毒性光源設計，尤其適合活細胞長期觀察。結合特異性熒光標記與定量分析，可為干細胞培養質量監控提供可靠數據支持。